این یکی از مراحل حساس در انجماد (cryopreservation) مواد گیاهی است. اولین انجماد موفق نوک ساقه و جنین های سوماتیک با استفاده از روش های مرسوم دِهیدراته کردن سلول های یخ به ترتیب در نخود (هاسکین، 1990) و هویج به دست آمد (لکوتوکس و همکاران 1991). روش های مرسوم با موفقیت به سیستم کشت تمایز نیافته مانند سوسپانسیون های سلولی و کالوس ها و همچنین نوک ساقه ی گونه های متحمل به سرما استفاده شده است(انگلمن، 2004).
با این حال، زمانی که این روش برای نوک ساقه به کار گرفته شد، به ویژه در گیاهان گرمسیری، مناطق زیادی از گنبد راسی از بین می روند، و گیاهان به طور غیر مستقیم از طریق تشکیل کالوس باززایی می شوند. جنین های سوماتیک مرکبات منجمد با این روش گیاهان از طریق جنین زایی خودبخودی جایگزین جوانه زنی مستقیم باززایی شد. حذف آب درون سلولی با سرد کردن آرام برای جلوگیری از تشکیل یخ کافی نیست. کاساوا یک استثنا در این زمینه است. این به توسعه یک روش فوق العاده سریع موثرتر انجماد منجر شده است. در هر دو روش انجماد، (آهسته و فوق العاده سریع) سلول ها آب قبل از غوطه وری در LN برای حداقل رساندن آسیب های برودتی داخل سلولی با تشکیل بلورهای یخ، دهیدراته می شوند.
(i)انجماد آهسته. در این روش کلاسیک ، نمونه های گیاهی ابتدا در یک سرعت کنترل شده 0.5-2 درجه بر دقیقه و تا 30- تا 40- درجه سانتی گراد پایین آمد و در این دمای پیش انجماد انتهایی، برای حدود 30 دقیقه قبل از انتقال آنها به نیتروژن مایع نگه داشته می شوند. سرد شدن آهسته با استفاده از یک سیستم خنک کننده قابل برنامه ریزی در کامپیوتر کنترل می شود.
در طول انجماد آهسته مایع خارج سلولی (مخلوط مایع داخل سلولی و منجمد) ابتدا یخ زده، و این هسته یخ خارج سلولی، کسری بخار آب بین داخل و خارج از سلول ایجاد می کند. در نتیجه، آب از داخل سلول حرکت می کند و باعث از دست دادن آب از سلول ها و کاهش نقطه انجماد محتویات سلول به علت افزایش غلظت آن است. دِهیدراته شدن محافظ سلول در طول سرد شدن آهسته به طور موثر مانع و یا کاهش تشکیل بلورهای یخ درون سلولی مضر در سیتوپلاسم یا واکوئل زمانی که به نیتروژن مایع منتقل می شود.
دِهیدراته شدن آب بدن در طول سرد شدن آهسته ممکن است آسیب اسمزی بعلت تغییرات کُشنده در حجم سلول و غلظت سمی املاح سلول (بنسون 1999) شود. برای جبران این خطر، عوامل انجماد خاص، مانند DMSO و گلیسرول، استفاده می شود. به طور کلی، اینها در ترکیب استفاده می شوند. انجماد نفوذی به عنوان یک عامل تثبیت کننده عمل می کنند. برای سلول های کشت سوسپانسیون، مخلوطی از 0.5٪ DMSO، 0.5٪ گلیسرول و 1 مول ساکارز به طور گسترده ای قابل اجرا است.
گاهی اوقات تنها ساکارز در غلظت کم (0.3 M) در محیط پیش کشت برای القاء تحمل به خشکی و در غلظت بالا (1 مولار) به عنوان انجماد استفاده شده است (ستیز، 1997). سلول های گیاهی به طور کلی در محلول انجماد، حدود یک ساعت قبل از انجماد بر روی یخ انکوباتور می شوند. انجماد به ویژه برای سلول ها با واکوئل بزرگ مهم است. انجماد نیز به عنوان آنتی اکسیدان و تثبیت کننده غشاء و پروتئین عمل می کند.
(ii)انجماد فوق العاده سریع. در این روش، که همچنین ویتریفیکاسیون نیز نامیده می شود ، مواد گیاهی ابتدا خشک شده و سپس به طور مستقیم در نیتروژن مایع غوطه ور می شوند. در طول خشک شدن، غلظت املاح پروتوپلاسم افزایش یافته و بسیار چسبناک می شوند. هنگامی که چنین ماده به طور مستقیم وارد نیتروژن مایع شود، آب دچار یک تغییر فاز از مایع به حالت شیشه ای می شود. این فرآیند فیزیکی ویتریفیکاسیون دارد (فاهی و همکاران 1984). ویتریفیکاسیون بر اساس پروتکل های انجماد ساده و برای اندام های پیچیده موثرتر است، مانند جنین، نوک ساقه، و به انجماد برنامه ریزی شده نیاز ندارد (ساکایی و همکاران 1990؛ لومباردی و همکاران، 2001).
این روش پیشرفت های قابل توجهی را در انجماد ژرم پلاسم اجازه داده است، به ویژه در شکل نوک ساقه و جنین های سوماتیکی که در روش مرسوم انجماد آهسته است که بطور موثر منجمد نمی شود (گونزالس و همکاران 2003). هنگامی که یک پروتکل مبتنی بر انجماد تحت شرایط بهینه اعمال می شود، همه و یا بیشتر ساختارهای مریستمی دست نخورده باقی بماند که تضمین باززایی مستقیم از گیاه بعد از ذخیره منجمد بدون فاز کالوس گذرا، اجتناب از ناپایداری ژنتیکی مرتبط با فاز کالوس می باشد (در ماتسوموتو و همکاران 1994).
خشک کردن قبل از انجماد سلول ها در مجاورت هوای استریل در ورقه های نازک محفظه جریان هوا به دست می آید و یا روش دقیق تر، با استفاده از جریان هوای فشرده استریل یا خشک شدن بر روی سیلیکا ژل است. با این حال، این روش ساده خشک شدن فقط برای مواد حساس به خشکی کاربرد دارد. بنابراین، پروتکل ها که در آن سلول ها با مواد فعال اسموتیک مثل ساکارز، قبل از تیمار خشکی با کاربرد گسترده تر توسعه یافته اند.
محلول ویتریفیکاسیون گیاهی (PVS2)، شامل غلظت بالایی از عوامل انجمادی (0.4 مول ساکارز، 30٪ گلیسرول، 15٪ اتیلن گلیکول، و 15٪ DMSO در محیط کشت MS)، که توسط ساکای و همکارانش در ژاپن توسعه یافت، به طور گسترده ای استفاده می شود. مدت زمان و دمای تیمار با این محلول ترکیبی از عوامل مهم هستند. روش های خنک کننده فوق العاده سریع، با استفاده از محلول PVS2، با موفقیت محیط-های رشد دهنده نوک ساقه در شرایط آزمایشگاهی چند رقم محصولات میوه معتدل و صنوبر (ساکایی، 1997)، (لومباردی و همکاران 2001)، و توت (نینو و همکاران 1992) گونه اعمال می شود.
پروتکل عمومی شامل:
(i) سخت شدن سرد/خشک در 4 درجه سانتی گراد در محیط حاوی یک ماده اسمزی برای 4-2 روز،
(ii) در محلول ویتریفیکاسیون به مدت 30 تا 90 درقیقه روی یخ انکوباتور شود،
(iii) انتقال به محلول انجماد حاوی مخلوط انجماد (0.75 میلی لیتر کلسیم در یک ویال 2 میلی لیتری) برای 30-90 دقیقه روی یخ و بستن با پوشش،
(IV) انتقال به نیتروژن مایع برای ذخیره سازی (لومباردی و همکاران 2001). اضافه کردن 10-4 مولار استیل سالیسیلیک اسید به محلول PVS2 نسبت بقای نوک ساقه های منجمد از Glehnia littoralis را از 43 به 87 درصد بهبود داده است (اوتوکیتا و همکاران ، 2009). بسیاری از روش های مختلف ویتریفیکاسیون بر اساس انجماد مواد گیاهی توسعه یافته اند:
• پیش کشت: نمونه ها در حضور منجمد کننده ها قبل از انجماد سریع آنها با غوطه وری مستقیم در LN کشت می شوند. این تکنیک برای کشت مریستم Musa انجام شده است (پانیس و همکاران، 2002).
• دِهیدراسیون. این ساده ترین روش بر اساس ویتریفیکاسیون است. نمونه ها در معرض جریان هوا هود لامینار یا محفظه جریان هوای استریل، هوای فشرده خشک (برجاک و همکاران 1989) و یا استفاده از سیلیکا ژل قبل از غوطه وری آنها را به LN انجام می شود. بقای بهینه به قرار گرفتن در معرض مستقیم LN زمانی که محتوای آب از نمونه ها به 10-20٪ (بر اساس FW) کاهش یابد، به دست می آید. این روش عمدتا برای جنین زیگوتی و محور جنینی تعداد زیادی از گونه های سخت اعمال می شود.
• دهیدراسیون پیش کشت: این ترکیبی از دو روش فوق است. این روش شامل کشت ریزنمونه در حضور منجمد کننده ها و سپس دهیدراته کردن قبل از غوطه وری در LN می باشد. این روش برای بخشهای بنیادی مارچوبه، کشتهای چند جنینی نخل روغنی و جنین زیگوتی نارگیل اعمال شده است.
• کپسوله سازی و دهیدراسیون. نمونه ها در Ca-آلژینات مانند دانه مصنوعی کپسوله شده و در محیط کشت مایع با غلظت ساکارز بالا قبل از دهیدراسیون پیش کشت می شود. این فرایند، دهیدراسیون شدید قبل از انجماد را اجازه می دهد، که در غیر این صورت برای نمونه های غیر کپسوله بسیار مخرب و یا کشنده است. این روش برای انجماد اپکس گونه های مختلف گیاهی از مناطق معتدل و گرمسیری بسیار موثر است (انگلمن، 2006).
• ویتریفیکاسیون (انجماد شیشه ای). در این روش ، ابتدا نمونه ها با منجمد کننده در غلظت های کم یا یک ماده اسمزی در یک محیط مایع برای اعمال قدرت تحمل دهیدراسیون و برای کاهش تنش مکانیکی ناشی از تیمارهای بعدی انجماد شدید برای 4-2 روز تیمار می شوند. مخلوطی از 2 مول گلیسرول و 0.4 مول ساکارز در محیط کشت مایع (محلول در حال بارگذاری) به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق برای افزایش قدرت تحمل اسمزی بسیار موثر است (ساکایی 2004). مخلوط ویتریفیکاسیونی که اغلب استفاده می شود PVS2 است (ساکایی 1992، 2004).
• کپسوله سازی و ویتریفیکاسیون. در این روش انجماد سریع نمونه های کپسوله شده قبل از غوطه وری در LN در تیمار ویتریفیکاسیون قرار می گیرند. این روش برای انجماد اپکس ساقه جهت افزایش تعداد گونه های گیاهی، مانند یام، سیب زمینی شیرین، آناناس، کاساوا استفاده شده است. (گونزالس و همکاران 2008) .
• ویتریفیکاسیون قطره. ریزنمونه با محلول های بارگیری و ویتریفیکاسیون در پروتکل ویتریفیکاسیون و انجماد در قطرات کوچک PVS2 که روی نوار فویل آلومینیوم قرار داده شده ، به طور مستقیم به LN فرو برده می شود. این روش با موفقیت سبب افزایش تعدادی از گونه های گیاهی شده است (ساکایی و انگلمن، 2007) .