این روش شامل نگهداری کشت ها تحت شرایط رشدی محدود برای طولانی تر کردن فواصل بین زیرکشت می باشد. گونه های گیاهی که ذاتا رشد آرام دارند می تواند برای چند ماه تحت شرایط کشت استاندارد نگه داشته شوند. به عنوان مثال، گیاهان Coffea arabica را می توان به مدت 12 ماه در 27 درجه سانتی گراد بدون نیاز به زیر کشت نگهداری کرد (چاریر، 1990)
با این حال، ذخیره سازی میان مدت بیشتر نیاز به تغییر شرایط محیطی و شرایط محیط کشت برای کم کردن سرعت رشد کشت ها دارد. موفق ترین استراتژی برای ذخیره سازی میان مدت ژرم پلاسم، ذخیره کشت ها در دمای پایین است. اصلاح محیط کشت با اضافه کردن ترکیبات اسموتیک فعال (به عنوان مثال مانیتول) یا کاهش تنظیم کننده های رشد و یا وضعیت مواد مغذی، کاهش سطح اکسیژن، و خشکی بافت از روش های دیگر برای ذخیره سازی میان مدت از ژرم پلاسم هستند.
یکی از اولین برنامه های برای استفاده شرایط روش تکثیر درون شیشه ای برای گونه های نادر و در معرض خطر ایجاد واحد ریزازدیادی در باغ گیاهی رویال ، KEW در سال 1974 بود (بنسون، 1999). از آن زمان کشورهای متعددی برنامه های خود را برای ریزازدیادی و حفاظت از گونه های در معرض خطر آغاز کرده اند.
در سال 1986، یک مرکز ملی برای مخزن کشت بافت (NFPTCR) در NBPGR ، دهلی نو، با هدف ذخیره کوتاه مدت، میان مدت و بلند مدت براساس کشت درون شیشه ای، گرده و بذر گیاهان اقتصادی شامل گونه های در معرض خطر تاسیس شد. NFPTCR تا کنون بیش از 2000 گونه در بانک ژن در شرایط آزمایشگاهی برای تقریبا 25 سال نگهداری می شود (گزارش 2010 NBPGR).
(i)ذخیره سازی سرد. ذخیره سازی ژرم پلاسم در دمای پایین بدون انجماد بسیار موفق بوده است. در دماهای پایین تر، پیری بافت های گیاهی آهسته است. درنتیجه، زیرکشت ها از مواد گیاهی مورد نیاز است البته نه به دفعات زیاد. دمای بهینه ذخیره سازی بستگی به حساسیت گونه دارد. در حالی که برای گونه های معتدل آن محدوده 5-9 درجه سانتی گراد و برای گونه های گرمسیری اغلب کمی بالاتر است.
مالین و شلگل (1976) گیاهان توت فرنگی عاری از ویروس در شرایط آزمایشگاهی به مدت 6 سال در 4 درجه نگهداری کردند. چند قطره از محیط مایع هر 3 ماه به کشت اضافه شد. پریل و هافمن (1985) 700 لاین اصلاحی گل داودی در 2-3 درجه در نور پراکنده (10-15 لوکس) ذخیره کردند. برخی از لاین ها در شرایط رشد محدود 5 سال زنده ماندند. هوادهی کشت ها برای جلوگیری از انجماد (vitrification) شاخه ها در طول ذخیره سازی ضروری بود. ذخیره سازی سرد در تاریکی به القاء انجماد شاخه شناخته شده است (ویلیامز و تاجی 1987).
شاخه های چغندر (Beta vulgaris) می تواند به مدت 12 ماه در 5 درجه و نور پراکنده زنده نگه داشته شود. شاخه های ریشه دار شده بقای بهتر نشان دادند ، همچنین برای arabica Coffea گزارش شده است (کارتا و همکاران 1981). ژرم پلاسم سیب زمینی می تواند در قالب ریز غده (microtubers) به جای کشت ساقه بصورت انبار سرد ذخیره می شود (کویاتکوسکی و همکاران 1988).
کشت نوک ساقه کیوی می تواند در 8 درجه سانتی گراد برای حدود یک سال با 100٪ بقا نگهداری شوند (مونت، 1986). شاخه های بازیابی شده پس از 52 هفته ذخیره سازی، در شرایط طبیعی رشد و تکثیر قرار داده می شوند. مشابهاً، کشت های Colocasia esculenta ، گونه های گرمسیری دیگر، ذخیره سازی در شرایط 9 درجه به مدت 3 سال به انبارمانی مقاوم است (زندورت، 1986).
گیاهچه ها و جنین های سوماتیکی نخل روغنی قادر به تحمل قرار گرفتن در معرض دمای زیر 18 درجه سانتی گراد حتی به مدت کم نیستند (کوربینوآ و همکاران 1990). بطور مشابه، ارقام موز ذخیره شده در زیر 5 درجه سانتی گراد آسیب ویا در عرض 3 ماه از بین رفت.
در 15درجه برخی از ژنوتیپ ها تا 17 ماه با قابلیت زنده مانی 92 درصد زنده ماندند اما برخی دیگر قابلیت زنده مانی آنها پس از 3 ماه به 50٪ کاهش یافت (جدوگاه و ویلیامز 1986). با توجه به پژوهش کو و همکاران (1991)، بهترین شرایط برای ذخیره سازی شاخه موز، آنها را بر روی کاغذ پنبه اشباع 3 درصد از ریبوز، پیچیده شده در تور و در 17 درجه انکوبه شود. موز کاوندیش که در این شرایط ذخیره شده به مدت 24 ماه 64٪ بقا نشان داد ، و بسیاری از گیاهان تکثیر شده از مواد ذخیره ای در جای سرد، طبیعی بودند.
گیاهان کاساوا نیاز به ذخیره در دماهای بالاتر از 20 درجه سانتی گراد دارند (روجا و همکاران 1984). ذخیره سازی سرد در صنعت تکثیر گیاهان با روش ریز ازدیادی بسیار مفید است. استوک کشت مغز را می توان در مرحله خواب در طول فصل کم تقاضا بدون نیاز به بازکشت مکرر نگه داشت. بطور مشابه، مواد تحقیقاتی اگر برای مدتی از زمان، مورد نیاز نیست، در شرایط آزمایشگاهی می توان ذخیره کرد.
یکی از مشکلات ذخیره سازی سرد ژرم پلاسم، ممکن است بعضی از مواد به شرایط رشد کم، عادت تدریجی پیدا کنند.
(ii)ذخیره سازی در محیط کم اکسیژن. ذخیره سازی در دمای پایین یک گزینه پرهزینه در کشورهای گرمسیری است. تجهیزات پر قدرت تفکیک، به خصوص در فصل تابستان از دست دادن ژرم پلاسم ذخیره شده را به خطر می اندازد. در این زمینه، ذخیره سازی مواد گیاهی در حرارت نرمال اتاق کشت (25 درجه) در محیط کشت محدود کننده رشد یا محیط گازی یک گزینه جذاب برای ذخیره سازی ژرم پلاسم میان مدت است.
در ذخیره مواد گیاهی از طریق کاهش سطح اکسیژن موجود درکاهش دما موفقیت های قابل توجهی بدست آمده است. ساده ترین راه برای کاهش غلظت اکسیژن موجود، پوشش دهی بافت با روغن های معدنی است. این تکنیک برای اولین بار توسط کاپلین (1959) در کالوس هویج استفاده شد. هیچ یک از کالوس های جنین انگور پس از 360 روز ذخیره سازی در 10-15 درجه بازیابی نشدند.
بهرحال اگر کالوس در طول ذخیره سازی سرد در سیلیکون غوطه ور شوند، زنده مانی بالا (95٪) و تکثیر گیاهان را نشان دادند (موریگوچی و همکاران 1988). جنین سوماتیکی نخل روغنی به مدت 4 ماه در یک اتمسفر 1٪ اکسیژن ذخیره شده و تکثیر سریعی را نشان داد (انگلمن، 1990). جنین های شاهد، در شرایط استاندارد کشت شده و به شدت آسیب دیدند. سیلیکون تقریبا هشت برابر بیشتر اکسیژن حلالیت در آب دارد (موریگوچی و همکاران 1988).
یک مشکل عمده در پُرآوری کشت تحت سطح کم اکسیژن، انجماد شاخه است.
لاین های سلولی Panax ginseng و گل پریوش (Catharanthus) پتانسیل رشدشان را تحت روغن معدنی به خوبی و همچون سلول های منجمد حفظ کردند، اما ظرفیت بیوسنتز آنها مانند لاین های حفظ شده در دمای معمولی با بازکِشت منظم از دست دادند. در مقابل، سلول های منجمد ظرفیت خود را برای سنتز کاتارانتین (catharanthine) و جینوزاید (ginsenosides) حفظ کرد (مانونن و همکاران 1990).
(iii) اصلاح محیط کشت. رشد کشت شاخه را می توان در درجه حرارت نرمال با اضافه کردن مواد اسموتیک فعال (مانند مانیتول، تاخیر اندازهای رشد)، کاهش غلظت مواد معدنی خاص (مانند نیتروژن، منیزیم)، و یا بالا بردن غلظت ساکارز به تعویق انداخت. اصلاح محیط کشت با افزودن 10 درصد ساکارز و یا بالا بردن غلظت آگار به 2٪ یا کاهش غلظت نمک به یک چهارم در بالا بردن نسبت زنده مانی (73-80٪) از شاخه های گلابی به مدت 2 سال در 5 درجه موثر بود (اوکاو نینو، 1996).
مجموعه یام در انستیتو Recherche فرانسه در محیطی با مواد معدنی وساکارز کم نگهداری می کنند (مالااوری، 2001). بسیاری از نمونه های سیب زمینی در مرکز بین المللی سیب زمینی (لیما، پرو) می تواند تا بیش از 4 سال حفظ، بدون یک بازکِشت، با ترکیب تنش اسمزی (4٪ سوربیتول و 8٪ آگار)، درجه حرارت پایین (6 درجه) و شدت کم نور (100 لوکس) حفظ شوند (گلمیرزایی و تولدو، 1999).
(IV) خشک کردن. خشک کردن بخشی از کالوس و جنین سوماتیکی نیز برای ذخیره سازی میان مدت ژرم پلاسم آزمایش شده است. تیمار ABA، اغلب در ترکیب با غلظت بالایی از ساکارز (9٪ و یا بالاتر)، تحمل به خشکی سلول را افزایش می دهد. کالوس هویج در سیستم جریان هوای آرام محفظه در یک شب خشک شده، پس پیش تیمار با ABA و غلظت بالایی از ساکارز، می تواند در 80 -، 20-، 15- درجه و یا برای یک سال در مرحله زنده ذخیره شود ( نیچه، 1980).
کالوس ها از ارقام مختلف از برنج ژاپنی و هندی برای مدت 3 ماه در خشکی با 10-5 مولار ABA و 9 درصد ساکارز با خشک کردن آهسته در محیط کشت به دنبال حفظ توتی پوتنسی طبیعی (totipotent) خود تیمار شدند (شین و همکاران 1991).
باززایی گیاه از جنین های سوماتیکی خشک نیز برای چند گونه، از جمله چمن باغ (گری، 1987) و یونجه (سناراتنا و همکاران 1989) گزارش شده است. جنین های سوماتیک یونجه می تواند تا 15٪ محتوای آبی خشک و به مدت 8 ماه در دمای اتاق ذخیره شوند. تحمل خشکی جوانه جانبی مارچوبه، بطور قابل توجهی با پیش کشت در یک محیط کشت حاوی 0.7 مولار ساکارز افزایش یافته بود (اوراگامی و همکاران 1990).