پروتوپلاست :
یاخته های گیاهی علاوه بر غشاء سیتوپلاسمی دارای یک دیواره سلولی از جنس سلولز هستند
که به آنها دوام بخشیده ، مانع خرد شدنشان شد ه و از ورود عوامل بیماری زا و تا حدودی تغذیه حشرات و آفات جلوگیری می کند.
پروتوپلاست عبارتست از یک یاخته گیاهی یا باکتریایی که دیواره سلولی آن برداشته شده باشد. گاهی پروتوپلاست یاخته های باکتریایی را اسفروپلاست گویند بنابراین پروتوپلاست شامل غشا ء پلاسمایی و تمام محتویات داخل سلول اعم از شیره سلولی ، اندامک ها و هسته است .
بر اساس نظر لانگر(1977) و واسیل(1980) پروتوپلاست جدا شده تنها یک تک یاخته لخت بوده که توسط غشاء پلاسمای احاطه می شود و پتانسیل ایجاد دیواره سلولی، تقسیم سلولی ، رشد و ایجاد یک گیاه کامل را دارا است.
پروتوپلاست ، سلولی گیاهی است که دیواره سلولی آن حذف شده باشد. بعد از حذف دیواره محکم سلول تنها یک پلاسمای غشایی نازک ، سلول رااحاطه می کند . استفاده های زیادی از پروتوپلاست صورت می گیرد
هیبرید های غیر معمول را که نمی توان با تلاقی جنسی انجام داد، با امتزاج پروتوپلاست دوگونه متفاوت می توان انجام داد، مثل سیب زمینی و گوجه فرنگی (بلیچر و همکاران ، 1978) مضاف بر این ترانسفورماسیون پروتوپلاست ها یا ژنهای خارجی منجر به بهبود معنی دار محصول می شود.
انتقال مستقیم DNA از طریق الکتروپوریشن و انتقال غیر مستقیم آن از طریق پلی اتیلن گلیکول ( PEG ) نیز منجر به تولید گیاهان تراریخته می گردد .
پروتوپلاست ها همچنین می توانند در بروز موقت ژن مورد آزمایش روی گیاه ، قابل استفاده باشند.
بااستفاده از پروتوپلاست ها ، مطالعه مسایل فیزیولوژیکی سلول امکان پذیر است . چون دیواره سلولی وجود ندارد . با استفاده از پروتوپلاست ها بررسی اثرا ت مواد خارجی روی فعالیت سلول تسهیل می گردد.
برای ایزولاسیون پروتوپلاست ها می توان سلولها را از منابع مختلف نظیر کالوس ، کشت های سوسپانسیون و بافت گیاهی ، تهیه نمود. برگهای جوان یک منبع عالی هستند. وقتی از برگها استفاده می کنیم ، در صورت امکان لایه اپیدرمی سلولها برداشته می شود و مزوفیل در معرض آنزیم هضم کننده دیواره سلولی قرار می گیرد.
اگر لایه اپیدرمی به آسانی قابل برداشت نباشد ، برگها را می توان به صورت نوار های کوچک بریده و لایه مزوفیل را در معرض آنزیم قرار داد. دیواره سلولی معمولا با هضم آنزیمی ، برداشته می شود. برای تبدیل بافت به سلولهای مجزا از هم ، آن را در آنزیم پکتیناز قرار می دهند. برای هضم دیواره سلولی نیز از آنزیمهای سلولاز یا همی سلولاز استفاده می شود و در نتیجه پروتوپلاست ها فراهم می شوند .
در هنگام استفاده از هضم آنزیمی حفظ پتانسیل اسمزی محیط هضم کننده در شرایط ایده آل برای ممانعت از چین خوردگی و ترکیدن پروتوپلاست ها مهم است . برای این کار آنزیم ها به محلول نمکها و ویتامین ها اضافه می شوند و پتانسیل اسمزی با مانیتول ، سوربیتول یا ترکیبی از این دو تنظیم می شود. PH محیط هضم کننده نیز باید برای فعالیت اپتیمم آنزیم و رشد سلول تنظیم شود.
پروتوپلاست های گیاهی به عنوان وسیله ای برای بهنژادی یعنی تولید پروتوکلون (Protoclone) (گیاهان جدیدی که از پروتوپلاست ها به دست می آیند یک نوع ماده کلونی می باشند) که هم اکنون به عنوان اجزاء برنامه های بهنژادی می باشند به کار می روند، مثل آلودگی با پلاسمید های باکتری آگروباکتریوم تومفاسینس (Agrobacterium tumefaciens ) در آزمایش های مهندسی ژنتیک .
استفاده از دانه گرده
جدا سازی پروتوپلاست از دانه گرده یک سری امکانات جالبی را فراهم می سازد. منبع پروتو پلاست با این روش به راحتی و به تعداد زیاد به دست می آید و از لحاظ پلوئیدی یکنواخت است
با امتزاج پروتوپلاست ها به جای دوبرابر کردن تعداد کروموزوم ها ( برای ایجاد تتراپلوئید ) می توان می توان دیپلوئید طبیعی جهت تشکیل دورگ جدید به دست آورد . همچنین با استفاده از پروتوپلاست حاصل از دانه گرده می توان گیاهک های هاپلوئید را باز آفرینی کرد .
یکی از محاسن دانه گرده داشتن کالبد با کیفیت عالی بوده و دیواره سلولی آن از نظر شیمیایی کمپلکس می باشد. دیواره سلولی آن از یک غشاء خیلی مقاوم از نوع Sporopollenin که یک پلی مراز استر های کارتنوئید می باشد تشکیل شد ه است . این غشاء را می توان قبلا به وسیله تیمار با محلول ها ی اکسید کننده قوی از دانه گرده جدا کرد .
دانه گرده یک منبع گیاهی خیلی خوب برای تهیه پروتوپلاست می باشد، زیرا دانه گرده از نظر سیتو پلاسم خیلی غنی بوده و هسته نیز در مرکز سلول قرار دارد. مواد گیاهی که دارای وا کوئل های بزرگ می باشند. منبع اولیه خوبی برای تهیه پروتوپلاست نمی باشند .
روشهای جداسازی پروتوپلاست
وقتی مواد گیاهی مناسب برای تهیه پروتوپلاست انتخاب شد نوبت جداسازی فیزیکی پروتوپلاست فرا می رسد.
جداسازی مکانیکی
بافتهای گیاهی را در امتداد خطوط مقطع با یک تیغ برش می دهند و بعضی از پروتوپلاست ها آزاد می شوند.
این روش امروز بندرت به کار می رود ، زیرا این روش یک پروسه بسیار طاقت فرسا می باشد و پروتوپلاست های کمتری را می توان از این طریق به دست آورد . تنها فرق که این روش با روشها ی معروف آنزیمی دارد این است که عوارض جنبی روش مخلوط آنزیمی ( و ناخالصی های موجود در آن ) را در غشاء سیتوپلاسمی ندارد .
جداسازی آنزیمی
در این حالت به خصوص منبع گیاهی مورد استفاده نوک شاخه است که از روش invitro به دست آمده است . و در دو مرحله انجام می شود مرحله اول سلولهای جدا شده از برگ و یا بافت های دیگر را با آنزیم ماسروزایم Macerozyme در داخل مانیتول 13 درصد تیمار می کنند. سلولهای جدا شده در این مرحله با کمک فیلتر خالص می شوند.
در مرحله دوم پروتوپلاست ها را با قرار دادن آنها در محلول 2 درصد سلولاز نگهداری آن به مدت حدود 90 دقیقه در آنکوباتور تهیه می کنند . به هر صورت آزمایشی که برای تهیه پروتوپلاست با روش یک مرحله ای از نوک شاخه سیب زمینی با روش in vetro انجام شده نشان می دهد که 2 الی 3 ساعت انکوباسیون در حرارت 20 تا 22 درجه سانتی گراد برای تهیه مقدار مناسبی پروتوپلاست کافی بوده است .
خالص سازی پروتوپلاست های جدا شده
در این مرحله پروتوپلاست ها را از مخلوط نگهداری شده در آنکوبا تور که در بالا توصیف شد، که حاوی مواد زاید سلولی و ارگانل های شکسته سلولی است جدا سازی پروتوپلاست ها از مواد زاید سلولی اطراف از روش های زیادی استفاده می کنند :
ته نشین سازی و شستشو
Sedimentation and washing
غوطه ور سازی
Flotation
استفاده از شیب غلظت در روش دو مرحله ای پرکول
Two- step percoll
روشهای کشت پروتوپلاست
بسته به روشهای سبک آزمایش گر و هدف مورد نظر روشهای معمول مورد استفاده عبارتند از :
1- خوابانیدن در آگار ( قالب گیری در آگار) Agar embedding
در این روش کشت امکان دارد پروتوپلاست ها را بعد ازباز آفرینی دیواره سلولی
به ماده حاوی آگار منتقل کرد و یا بعد از جدا سازی آنها را بلافاصله به روی آگار منتقل کرد
2- روش کشت در اطاقهای کوچک Microchambers
در این روش محل اتصال سیستم را با کمک روغن معدنی مسدود می سازند .
3- کشت به صورت قطرات معلق Hanging drop cultures
4- روش کشت چند قطره ای یاMDA Multi drop array techniques
برای تهیه پروتوپلاست می توان به صورت مستقیم و یا به شکل غیر مستقیم عمل کرد . در تهیه پروتوپلاست به شکل مستقیم ، می توان از بافت ها و اندام های مختلفی مانند برگ، ریشه ؛ غده ؛ گلبرگ ؛ میوه، یاخته های میکروسپور مرحله ای تترادی (هنگامی که میکروسپورها تک هسته هستند) استفاده نمود حتی درلگوم ها گزارشاتی درمورد استفاده از گرهک های ریشه جهت تهیه پروتوپلاست وجود دارد.
بهترین منبع برای تهیه پروتوپلاست ، یاخته های پارانشیم کلروفیل داربرگ (مزوفیل برگ ) می باشد از هر گرم مزوفیل برگ سیب زمینی می توان 10 به توان 8 پروتوپلاست جدا نموده که 70 -80 % این پروتوپلاستها ها زنده وفعال هستند
عملکرد پروتوپلاست وتوانایی باززایی آن درمحیط مصنوعی تحت تاثیر فاکتورهای متعددی مانند سن گیاه، سن اندام یا بافت مورد استفاده ، شرایط رشدی چون نور، دروه فتوپریود، رطوبت نسبی ، درجه حرارت ، تغذیه و توزیع دروه آبدهی قرار می گیرد.
در روش غیر مستقیم تهیه پروتوپلاست می توان از کشت های سوسپانسیون سلولی و یا کالوس استفاده نمود، پروتوپلاست های جدا شده از این منابع بهتر تقسیم شده و در محیط مصنوعی رشد می کنند لذا منبع قابل اعتمادتری محسوب می شوند.
اما گاهی موانعی چون مشکلات جدا کردن آنها ،شرایط نگهداری چنین بافتهایی و امکان ایجاد برخی ناهنجاری های ساختمانی و کروموزومی (مانند پلی پلوئیدی ) دراین روش وجود دارد، لذا طبق یک اصل کلی برای حفظ یاخته ها در نرخ رشد بالا وتقسیم مناسب، پیشنهاد می شود از یاخته های پروتوپلاست تهیه شود که در مراحل اولیه فاز لگاریتمی رشد خود هستند